Coprocultura- examen bacteriologic

Informatii generale si recomandari pentru efectuarea testului:   Coprocultura este examenul de baza in diagnosticul microbiologic al sindromului diareic infectios. Aceasta presupune izolarea agentului etiologic bacterian pe medii de cultura adecvate si identificarea lui pe baza caracteristicilor: morfologice, de cultivabilitate, enzimatice si antigenice. Limitandu-ne la infectiile bacteriene putem intalni urmatoarele situatii in care coprocultura este indicata:

• infectii cu localizare primara enterala si invazie ulterioara (aspect septicemic)
• infectii cu localizare exclusiv enterala sub forma clinica de enterocolite, boala diareica, toxiinfectii alimentare, evoluind sub forma acuta, subacuta, cronica, clinic inaparenta sau simplu portaj.
• Infectii bacteriene ale altor sisteme in care localizarea enterala este accidentala (tuberculoza, antrax)
• Schimbarea structurii florei bacteriene specifice intestinului care poate aparea in unele situatii patologice (colita pseudomembranoasa) sau ca o consecinta a selectiei unui grup de germeni, consecutiv antibioterapiei.

  In etiologia sindromului diareic infectios trebuie avute in vedere, in primul rand, enterobacteriile patogene pentru care diagnosticul etiologic este obligatoriu:   Flora bacteriana aeroba:

1. Enterobateriaceae patogene:

• Salmonella cuprinde peste 2300 serotipuri diferenţiate pe baza antigenelor somatice O şi flagelare H. Salmonelele patrund in organism pe cale digestiva si determina 3 sindroame clinice diferite: gastroenterite, septicemii cu leziuni metastatice si febre enterice. Salmonelele pot fi grupate in: salmonele tifoidice, agenti etiologici ai febrelor enterice, au habitat uman (S.typhi, S.paratyphi A, B si C) si salmonele non-tifoidice cu habitat animal si frecvent uman (S.typhimurium, S.enteritidis, S. anatum, S.cholerae suis, S.panama, S.agona etc).
• Shigella: agenti etiologici ai dizenteriei, sunt bacterii enteroinvazive, penetreaza si se inmultesc in enterocit. Biochimic si antigenic au fost delimitate 4 specii: grupul A - S.dysenteriae (12 serotipuri), grupul B - S.flexneri (6+2 serotipuri), grupul C - S.boydii (18 serotipuri) si grupul D - S.sonnei (1 serotip care prezinta 2 faze antigenice S si R).

Escherichia coli enteropatogen (EPEC produce enterotoxina shiga-like determinand diaree apoasa la copii pana la 2 ani fara febra si cu fenomene inflamatorii reduse), enterotoxigen (ETEC este non-invaziv, determina diaree apoasa la copii fara inflamatie si fara febra - “diareea calatorilor”), enterohemoragic (EHEC apartin serotipului O157:H7, produce in cantitati mari o enterotoxina shiga-like, initial determina o diaree apoasa care apoi devine hemoragica cu raspuns inflamator intens – colita hemoragica), enteroinvaziv (EIEC determina inflamatie severa cu febra si diaree muco-sanguinolenta), enteroaderent (EAdEC), enteroagregativ (EaggEC produce enterotoxina si hemolizina determinand copii mici diaree apoasa persistenta fara febra si fara inflamatie).

• Yersinia spp: Yersinia enterocolitica odata patrunsa in organism, determina o serie de manifestari clinice, precum: enterita, enterocolita cu diaree autolimitanta; adenita mezenterica si ileita terminala sunt provocate in special de specia Yersinia pseudotuberculosis .Infectiile cu Y enterocolitica predomina in lunile reci ale anului. Consumul de carne cruda de porc, reprezinta un factor de risc important pentru infectia cu acest patogen. Utilizarea unor medii de cultura speciale selective si imbogatite, permite izolarea yersiniilor din materiile fecale. Aceste metodele microbiologice, folosite pentru izolarea yersiniilor, sunt foarte costisitoare, ele realizandu-se doar in urma unor solicitari speciale venite din partea clinicianului.

2. Vibrio cholerae, produce holera, o toxiinfectie alimentara caracterizata clinic prin diaree apoasa urmata de deshidratare grava, colaps algid, alterarea profunda a starii generale, cu evolutie grava si o mortalitate de 50-80% daca nu este tratata si de 1-2% sub tratament. Cel mai important caracter de patogenitate este reprezentat de producerea de toxina Suportul material al transmiterii este apa si alimentele contaminate (in special carnea vietuitoarelor acvatice). In zonele temperate se izoleaza din ape, plancton, peste, moluste si crustacee in anotimpurile calduroase. In fructe, peste si alte vietuitoare marine rezista 2–3 zile la temperaturi de 20-30ºC, iar in unt si inghetata mai multe zile. In scaunul bolnavilor rezista cateva zile la frig. Holera este o infectie intestinala localizata. Diagnosticul de laborator al holerei, se bazeaza pe izolarea si identificarea vibrionului holeric din materiile fecale; nu se face de rutina in laboratoarele de microbiologie. Confirmarea diagnosticului se face la nivelul laboratoarelor de referinta.
3. Enterobacteriaceae conditionat-patogene:

Klebsiella spp. (sindromul diareic al noului nascut), Serratia marcescens (“sindromul scutecului roşu” – prin colonizare anormala cu aceasta bacterie la nou nascuti).

4. Alti bacili Gram-negativi: Aeromonas, Alcaligenes, Plesiomonas
5. Coci Gram-pozitivi: Staphylococcus aureus: unele tulpini de aureus produc o enterotoxina termostabila si rezistenta la enzimele digestive. Enterotoxina ingerata cu alimentele in care s-a acumulat determina intoxicatii alimentare. Vindecarea survine spontan dupa 24-48 ore prin eliminarea toxinei din organism. Stafilococii enterotoxigeni se inmultesc la temperatura camerei in alimente cum sunt laptele, produse de cofetarie cu crema de lapte, carnea si produsele de carne, care sunt contaminate la sursa (vaci cu mamita stafilococica) sau pe parcursul prelucrarii (manipulare neigienica de personal cu stafilococi sau purtatori sanatosi de stafilococi enterotoxigeni).

Flora bacteriana anaeroba: Bacillus cereus, bacil saprofit al solului, contamineaza frecvent orezul si fructele uscate. Intoxicatia la om se manifesta dupa o incubatie de 10-12 ore prin diaree apoasa, uneori varsaturi si se vindeca in urmatoarele 12-24 ore. Clostridium difficile determina o infectie intestinala bacteriana care apare la persoanele  care au suportat terapii antibiotice prelungite; bacteria fiind un comensal al tubului digestiv devine patogena in anumite conditii favorabile. Este cea mai intilnita infectie dobindita de bolnavii internati in spital (enterocolita pseudo-membranoasa post antibioterapie). Severitatea colitei variaza. In cazurile cele mai grave toxinele eliberate sunt letale pentru mucoasa colonica, determinind ulceratii, necroza cu leucocite - membrane albicioase care acopera mucoasa colonica. Aceasta forma severa a colitei cu Clostridium difficile se numeste forma pseudo-membranoasa, deoarece pe suprafata mucoasei colonice se depun resturi necrozate cu leucocite care i-au aspectul unor false membrane.Infectia cu Clostridium difficile debuteaza printr-o alterare a florei bacteriene normale colonice, colonizarea cu clostridii si eliberarea de toxine care determina inflamatia si necroza mucoasei colonice. determinand o varietate de manifestari clinice, incluzind statusul de purtator asimptomatic, diareea usoara autolimitanta, colita pseudo-membranoasa si colita fulminanta. Clostridium perfringens: unele tulpini produc in cursul sporularii o enterotoxina care determina, prin pierdere hidroelectrolitica, diaree. Mai frecvent incriminate sunt preparatele din carne pastrate 1-2 zile la temperatura camerei si consumate reci. Vindecarea survine spontan in cca 24 ore. Clostridium botulinum: sporii acestei specii, raspandita in sol, pe fundul apelor statatoare si plante in descompunere, contamineaza frecvent legumele si carnea, au o termorezistenta remarcabila (supravietuiesc mai multe ore la 100⁰C, mor dupa 10 minute de autoclavare la 120⁰C). Clasic, botulismul este descris ca intoxicatie alimentara. Sunt incriminate alimente conservate in casa si pastrate o perioada dupa care sunt consumate fara pregatire termica. Botulismul debuteaza dupa 18-96 ore de la ingestia alimentului toxic. Pacientii au paralizii in sfera nervilor cranieni. Moartea se produce prin paralizie flasca a muschilor respiratori sau stop cardiac. Flora bacteriana microaerofila: Campylobacter spp.: Campylobacter jejuni si Campylobacter coli sunt implicate în numeroase episoade de toxiinfectie alimentara ce evolueaza cu diaree sangvinolenta sau apoasa, mai ales la copii. Germenii ajung in organism pe cale orala prin consum de alimente sau apa contaminate sau prin contact cu animale bolnave sau purtatoare sanatoase. Infectia tipica cu C. jejuni se manifesta prin enterocolita acuta cu dureri abdominale, diaree hemoragica, inflamarea stratului lamina propria si abcese criptice. Diareea are o evolutie autolimitanta, vindecandu-se spontan in 5-8 zile. Produsele patologice recoltate sunt materii fecale, vomismente, alimente (carne, lapte, produse lactate). Necesita conditii speciale de cultivare: microaerofilie, medii speciale imbogatite si o temperatura de crestere de 42-43ºC si nu intra in practica curenta a diagnosticului bacteriologic. Infectia micotica: Toate speciile de Candida se pot intalni ca germeni comensali la om, in special in materiile fecale. Candidoza este adesea precedata de cresterea colonizarii fecalelor cu Candida, datorita tratamentului cu antibiotice cu spectru larg. Factori suplimentari locali si sistemici favorizeaza infectia, in special cu Candida albicans Pe frotiuri colorate Gram se urmareste prezenta levurilor în cantitate mare si predominanta fata de flora bacteriana normala din materiile fecale diminuata. Este decisiva cultivarea materiilor fecale in vederea izolarii, cuantificarii levurilor si determinarea sensibilitatii la antifungice (antifungigrama). In vederea stabilirii etiologiei micotice a sindromului diareic se va efectua examenul cantitativ al levurilor, respectiv determinarea numarului de unitati formatoare de colonii micotice(UFC)/g sau ml de materii fecale, semnificativ cantitativ fiind un numar >10⁹ UFC/g sau ml materii fecale.   Prelevarea probelor Probele se recolteaza de catre pacient, din scaun emis spontan. Prelevarea se face cu lingurita coprorecoltorului vizand portiuni lichide si mai ales cele mucoase sau sangvinolente, daca exista. Cand acestea lipsesc se recolteaza boluri fecale din trei locuri diferite Volumul recoltat trebuie sa fie de minim 5 ml sau cat o aluna daca scaunul este format. Coprorecoltorul trebuie să contina mediul de conservare (Cary Blair). Transportul probei la laborator se realizeaza in max 2-3 ore de la recoltare, fara a fi pastrata la frigider. Pe biletul de trimitere care însoteste proba se va mentiona suspiciunea clinica pentru care se solicita coprocultura. Se recolteaza inainte de inceperea tratamentului antibiotic. La bolnavii cronici, purtatori, persoane spitalizate, scaunul va fi provocat printr-un purgativ salin. La bolnavii cu dizenterie bacteriana proba se poate recolta din colonul sigmoid cu sonda Nelaton nr. 16-18, sterilizata. Produsul recoltat se suspenda prin spalarea sondei in 2ml solutie fiziologica sterila sau lichid conservant.   Semnificatie clinica:   Pentru izolatele cu semnificaţie clinica se testeaza sensibilitatea la antibiotice prin antibiograma difuzimetrica. Identificarea culturilor si determinarea sensibilitatii la antifungice se face cu ajutorul unui sistem biochimic standardizat bazat pe fermentarea a 7 zaharuri si un test enzimatic. Pentru determinarea sensibilitatii la antifungice se foloseste tot un sistem standardizat, ce permite testarea urmatoarelor antifungice: Amfotericina B, Nystatin, Flucytosine, Fluconazol, Ketoconazol, Miconazol, Econazol.   Uzual, laboratorul  comunica urmatorii agenti patogeni enterici:

• Salmonella spp.,
• Shigella spp.,
• E coli (EPEC – numai la copii <2 ani),
• Klebsiella spp – la copii pana in 2 luni, atunci cand pe mediile de cultura cresterea este predominanta,
• Candida albicans.