Examinare citologic frotiu sanguin ( venos, capilar)

Examenul citologic al frotiului sangvin este o investigatie care aduce numeroase informatii si cu o mare valoare diagnostica pentru diagnosticul pozitiv si diferential atat al bolilor hematologice, cat si al celor nehematologice, ajutand totodata si la identificarea si corectarea erorilor determinate de instrumentele automate de numarare.

INDICATIILE TESTULUI:

• Evaluarea pacientilor cu boli hematologice: anemii fara o cauza evidenta, sindroame hemoragipare, sindroame febrile prelungite de origine necunoscuta, organomegalii ( hepato-spleno-megalie, adenomegalie)
• Evaluarea pacientilor cu boli nehematologice: infectii bacteriene, parazitoze, ictere, cancere
• Personalul laboratorului poate initia examinarea frotiului de sange atunci cand exista modificari ale hemoleucogramei sau cand exista anumite avertizari ale analizorului automat.

Frotiurile de sange pentru examen citologic pot fi: frotiuri din sange capilar sau frotiuri din sange venos.

Examenul microscopic al frotiului de sange depinde in mare masura de calitatea efectuarii frotiului sangvin.

Frotiul de sange capilar: este realizat din sange capilar  prin etalarea pe o lama de sticla a unei picaturi de sange obtinute prin punctionarea pulpei degetului la adult sau a fetei plantare a calcaiului la nou-nascut.

Punctionarea se realizeaza cu lantete de unica folosinta dupa dezinfectia locului de punctionat. Zona ce urmeaza a fi punctionata va fi perfect uscata pentru a preveni hemoliza elementelor .

Frotiul se va efectua din a doua picatura de sange, prima picatura fiind indepartata, deoarece poate fi diluata cu fluid tisular.

Acest tip de frotiu este cel mai indicat pentru efectuarea examinarii morfologice a elementelor celulare, fiind lipsit de artefactele datorate anticoagulantelor.

Frotiul de sange venos: este realizat din sangele recoltat pe anticoagulant ( EDTA).

Recoltarea sangelui se face de electie prin flebotomie din vena cubitala mediana sau cefalica a bratului, in recipient care contin anticoagulant ( EDTA), dupa dezinfectarea zonei de punctie si uscarea perfecta . Dupa recoltare, tubul de recoltare se va rasturna de cateva ori pentru o buna omogenizare a sangelui recoltat cu anticoagulantul si pentru prevenirea coagularii.

Frotiurile de sange venos sunt utile pentru validarea masuratorilor efectuat pe analizorul automat de hemoleucograme, detectand astfel posibile artefacte sau interferente in numaratoarea elementelor celulare datorate anticoagulantului, vreunui defect de recoltare, prezenta macro- sau megalotrombocitelor, a schizocitelor .

TEHNICA DE LUCRU:

Frotiurile de sange venos trebuie efectuate in maxim 6 ore de la recoltarea sangelui.

Efectuarea frotiului de sange presupune etalarea unei picaturi de sange pe o lama de sticla in strat cat mai subtire, pentru a se evita suprapunerea elementelor celulare.

Se depune o picatura de sange  pe lama de sticla. Cu ajutorul unei alte lame de sticla avand capetele slefuite se va etala picatura de sange pe lama astfel: se aplica lama slefuita in fata picaturii de sange avand un unghi de inclinare de 30 grade, se intinde picatura de sange prin capilaritate pe toata latimea lamei slefuite, surplusul de sange se sterge de o bucata de tifon steril, apoi lama slefuita se impinge inainte cu o miscare continua si sigura. Daca unghiul ales si viteza sunt prea mari, frotiul va fi prea gros si prea scurt; un sange vascos trebuie intins sub un unghi mai ascutit, iar un sange prea subtire trebuie intins sub un unghi mai obtuz.

Un frotiu corect etalat trebuie sa ocupe aproximativ ¾ din suprafata lamei, sa aibe capete franjurate, sa nu aibe intreruperi sau aspect granulos.

Dupa etalare, frotiul de sange trebuie rapid uscat prin vanturarea sa in aer.

Frotiul corect etalat si uscat va fi colorat May Grunwald Giemsa pentru examinarea microscopica: realizarea formulei leucocitare si identificarea modificarilor morfologice ale eritrocitelor, leucocitelor si trombocitelor. Pentru aceasta se examineaza mai multe campuri, intr-o anumita ordine,  in zona in care frotiul are o etalare optima, elementele celulare nefiind suprapuse.

Seria rosie:

Eritrocitele normocitare si normocrome sunt acele eritrocite cu un diametru mediu de 7.5 μm, cu forma de discuri biconcave, avand o culoare mov-roz pe frotiul colorat MGG datorita continutului in hemoglobina, cu o depresiune centrala ( o zona mai palida).

MODIFICARI ALE SERIEI ROSII:

1.Modificari de marime ale eritrocitelor ( Anizocitoza eritrocitara): microcite sau macrocite

• Microcitele sunt acele eritrocite cu diametre < 7 μm. Apar frecvent in anemia microcitara hipocroma feripriva, in anemia din bolile cornice, in sindroame talasemice
• Macrocitele sunt acele eritrocite cu diametre >10 μm. Fiziologic apar la nou-nascut, gravid, persoane varstnice. Cauze frecvente ale macrocitozei sunt: deficitul de vitamina B12 sau de acid folic, boli hepatice, etilism cronic, reticulocitoze post-hemoragice sau din hemolizele autoimmune, mieloftizie, SMD, etc.

2.Modificari de forma ale eritrocitelor ( Poikilocitoza):

-Ovalocite= eritrocite ovalare, alungite, avand axul lung mai mic fata de dublul axului mic al hematiei

- Eliptocite = eritrocite aplatizate, avand axul lung mai mare decat dublul axului mic al hematiei

Un procent de 1% de ovalocite, eliptocite se poate intalni in frotiurile adultilor sanatosi;

Un procent redus de ovalocite- eliptocite se intalneste in anemiile feriprive, SMD, mielofibroza, unele talasemii, etc.

Un procent >20% de ovalocite-eliptocite se intalneste in ovalocitoza/ eliptocitoza ereditara.

• Dacriocite = eritrocite in forma de lacrima sau de para; Se intalnesc frecvent in: sindroame talasemice, mielofibroza, infiltrari medulare, alaturi de alte modificari morfologice ale celulelor sangvine, dar si in anemii feriprive.
• Echinocite = eritrocite cu contur crenelat, avand proiectii citoplasmatice scurte, uniform distribuite pe suprafata celulei; procent crescut de echinocite intalnim in: sindrom hemolitico-uremic, tumori, deficit de piruvat-kinaza
• Acantocite= eritrocite cu contur neregulat, avand proiectii citoplasmatice de marimi si forme diferite; intalnite in: a-beta-lipoproteinemii, anomalii ce intereseaza proteinele din membrana eritrocitului, metastaze hepatice, ciroza alcoolica, malnutritie severa, etc.
• Stomatocite = eritrocite cu depresiunea centrala liniara; pot aparea atat in frotiurile normale intr-un mic procent; in procent mare se intalnesc in afectiuni hepatice, alcoholism, unele tumori maligne, in stomatocitoza ereditara
• Sferocite= eritrocite rotunde ce si-au pierdut aspectul discoid, fara depresiune centrala; se intalnesc in sferocitoza ereditara ( aspect de microsferocite), in anemii hemolitice autoimune sau induse medicamentos, reactii post-transfuzionale imediate, etc.
• Schizocite=  sunt fragmente eritrocitare cu forme variabile, ce apar datorita unei agresiuni mecanice, toxice, termice asupra eritrocitelor. In procente mici ( sub 1%) pot fi intalnite la indivizii sanatosi; in procente mari (>1%) se intalnesc in anemii hemolitice autoimune din cadrul sindromului hemolitico-uremic, purpura trombocitopenica sau secundare administrarii de mecamente, pre-eclampsie, eclampsie, sindromHELLP; pot fi  regasite si postsplenectomie, proteze valvulare sau vasculare, hemodializa, etc. Schizocitele cele mai sugestive pentru o hemoliza intravasculara mecanica sunt cele care au forma de casca, de triunghi.

3.Modificari de culoare ale eritrocitelor : Hipocromie sau Policromatofilie

- Hipocromia : cresterea depresiunii centrale a eritrocitelor (1/3 din diametrul celulei). Eritrocitulcu hipocromie maxima se numeste anulocit.

De obicei microcitoza se insoteste de hipocromie.

Codocitele ( eritrocite in semn de tras la tinta) sunt eritrocite care prezinta o zona centrala de hemoglobina inconjurata de o zona palida. Se intalnesc in anemiile feriprive, talasemii si alte hemoglobinopatii.

Hematii in tinta de dimensiuni mari, rotunde sau ovalare, se intalnesc in boli hepatice, etilism cronic.

- Policromatofilia: defineste eritrocitele mai mari ca si dimensiune decat cele normale, cu disparitia zonei palide central, cu o culoare violet-rozalie pe frotiul colorat MGG. Policromatofilele sunt expresia reticulocitelor pe frotiul de sange, fiind in esenta reticulocite immature, culoarea lor datorandu-se ARN-ului rezidual.

Reticulocitele adulte nu apar pe frotiul colorat MGG, ele necesitand coloratie supravitala.

4.Incluziile eritrocitare:

• Punctatiile  bazofile: punctatii fine, albastre, regulate, dispersate pe suprafata eritrocitului; apar in sindroame talasemice, anemii sideroblastice, intoxicatii
• Corpii Pappenheimer: punctatii grosiere, albastre, neregulate, dispuse grupat, de obicei la periferia eritrocitului; apar in anemii sideroblastice, talasemii, megaloblastoza, post-splenectomie
• Inelul Cabot: formatiune filamentoasa de culoare rosie, dispusa in eritrocit sub forma unui inel sau incolacit sub forma cifrei 8; apare in: anemii megaloblastice, anemii sideroblastice, diseritropoieze, SMD, sindroame mielo-proliferative
• Corpii Jolly-Howell: fragmente reziduale de nucleu, unici, perfect rotunzi si regulati, de culoare rosu-purpurie; intalniti in: postsplenectomie, anemii megaloblastice, talasemii, mieloftizie, SMD.

Seria alba

Realizarea formulei leucocitare:

Se recomanda numararea a 100 de celule leucocitare daca numarul total de leucocite este <20000/μL sau a mai multor sute de leucocite daca numarul total de leucocite este > 20000/ μL. In cazul leucopeniilor severe se recomanda efectuarea unui frotiu din concentratul leucocitar.

Anomalii morfologice ale leucocitelor:

• Granulatii anormale ( granulatii toxice in citoplasma granulocitelor): infectii severe, intoxicatii, stari toxice, terapie cu cytokine, sdr. Chediak-Steinbrinck-Higashi, rar in SMD, LAM
• Corpii  Auer: LAM3 promielocitara
• Corpii Dohle: sarcina, infectii, inflamatii, arsuri, SMD, LAM, post-chimioterapie
• Degranulare partiala sau totala a citoplasmei granulocitelor: SMD, infectii severe
• Hipersegmentarea nucleului granulocitelor: anemie megaloblastica, rar in SMD, uremie, LGC
• Hiposegmentarea nucleului granulocitelor ( anomalia Pelger-Huet): SMD, LAM, mielofibroza, LGC, cancere metastatice
• Anomalii ale condensarii cromatinei nucleare: LGC, SMD
• Prezenta precursorilor mieloizi in sangele periferic ( deviere la stanga a formulei leucocitare): LAM, SMD, LGC sau alte boli mieloproliferative cornice, cancere metastazate medular, anemii hemolitice severe, infectii.
• Vacuole citoplasmatice ale limfocitelor: boala Niemann Pick, glicogenoze, deficit beta-galactozidaza
• Limfocite reactive: dimensiuni variabile, spre mari, citoplasma cu bazofilie variabila, vacuolata, cu granulatii, nucleu mare, reniform, clivat sau in forma de trifoi, cromatina nucleara variabil condensata, cu nucleoli vizibili; apar in mononucleoza infectioasa ( aspect de celula in drapel), hepatite virale, toxoplasmoza, citomegalie, HIV, alte viroze ( celule Turk)
• Prezenta de umbre nucleare ( rezulta din ruperea unor limfocite fragile in cursul etalarii frotiului sangvin): sindroame limfoproliferative - LLC, limfoame, leucemie acuta
• Prezenta de celule paroase (limfocite mari, citoplasma abundenta, cu numeroase prelungiri fine dispuse pe toata suprafata celulei, nucleu cu forma variabila, cromatina slab condensate, cu nucleol vizibil): Leucemia cu celule paroase
• Prezenta de plasmocite normale : patologii asociate cu neutrofilie sau limfocitoza reactiva
• Prezenta de plasmocite  imature: mielom multiplu( celule mielomatoase), leucemia cu plasmocite

Seria trombocitara

Modificari morfologice ale trombocitelor:

Forma trombocitelor este variabila, cel mai frecvent regasindu-se trombocite rotunde, ovalare, dar si forme alungite, “in esarfa”.

• Prezenta de macrotrombocite ( trombocite cu diametru >4μm): poate aparea si la persoane sanatoase, dar si in PTI, PTT, CID, SMD, boli mieloproliferative cronice
• Prezenta de megalotrombocite ( trombocite gigante, de dimensiunea eritrocitului): sdr. Bernard Soulier, sindromul trombocitelor gri, sdr. May Hegglin
• Fragmente de nucleu de megacariocit sau chiar megacariociti sau megacarioblasti: pot aparea in boli mieloproliferative cornice, leucemii acute LAM7

Frotiurile efectuate din sange venos recoltat pe anticoagulant EDTA prezinta trombocite izolate, fara aglomerari. Uneori, datorita prezentei anticoaguantului EDTA trombocitele pot aparea pe frotiul de sange ca agregate, iar hemoleucograma efectuata pe analizorul automat poate prezenta falsa trombocitopenie. Acest lucru se poate corecta prin efectuarea unui frotiu din sange capilar ( arteriolar). Frotiurile efectuate din sange capilar, fara anticoagulant, prezinta trombocitele dispuse izolat si in grupuri , iar prin aprecierea grupelor trombocitare poate fi estimat numarul de trombocite, cat mai aproape de numarul real.

Examinarea frotiului de sange poate decela cateva aspect considerate critice: leucemii acute, trombocitopenii severe cu PTI, anemii severe, semne de anemie hemolitica microangiopatica ( sdr. hemolitico-uremic), poliglobulii marcate, modificari critice care impun comunicarea urgenta a rezultatelor.